諾獎級技術『光遺傳學』——更快、更精、更便捷操控細胞

來源: 上海吉凱基因化學技術有限公司   2019-11-4   訪問量:765評論(0)


光遺傳學(optogenetics)是一項結合了光學和遺傳學的技術,其原理是光敏蛋白在特定波長光照的刺激下會分別對陽離子或者陰離子的通過產生選擇性,如Cl-、Na+、H+、K+,從而造成細胞膜兩邊的膜電位發生變化,達到對細胞選擇性地興奮或者抑制的目的。其調控精度很高,在時間上最快可以實現亞毫秒級的調控,在細胞上可以精細到單細胞水平上的調控。光遺傳技術應用中主要有三部分組成:光敏蛋白、光敏蛋白表達遞送、光的遞送。目前光遺傳學技術正朝著光敏蛋白反應更快、表達更精準、光的遞送更方便的方向高速發展。

一、光敏蛋白選擇

光敏蛋白根據其功能可分為興奮性光敏蛋白和抑制性光敏蛋白。興奮性光敏蛋白基本都是由光敏感通道蛋白(Channelrhodopsins,ChRs)為基礎開發而來,ChRs為經典的非特異性陽離子通道,在藍光刺激后使神經元去極化。抑制性光敏蛋白則基本以鹽細菌視紫紅質(Halorhodopsins,HR)、菌視紫紅質(Bacteriorhodopsins,BR)等為基礎改造而來,HR為氯離子通道,黃光刺激后氯離子內流使細胞超極化,BR為質子泵,綠光刺激后質子外流使細胞超極化(圖1)。

圖1. 常用光敏蛋白

以往光遺傳技術應用中一般選擇光敏感蛋白ChR2(興奮)和eNpHR3.0(抑制),但是隨著新的改造型光敏蛋白的不斷問世,我們在光敏蛋白的使用上有了更多的選擇(表1)。ReaChR、Jaws等能透過皮毛、頭骨等激活深層組織細胞,具有很大的臨床應用潛力;soCoChR、Chronos、FLInChR等時間精度達到1毫秒以內,細胞精度可實現對單個細胞的操控,有效避免了其它干擾因素使得實驗結果準確度大大提高,尤其在研究神經環路對行為學影響時;ChR2-SFOs、VChR1-SFOs等雙穩態光敏蛋白可以精確控制光遺傳元件作用時間;stGtACR1/2由GtACR1/2改造而來,實現了胞體膜表達特異性并解決了軸突、樹突干擾的問題。


表1. 常用光敏蛋白列表

二、光敏蛋白表達遞送

與GFP的遺傳編輯類似,在特定細胞中表達光敏蛋白可通過病毒注射或轉基因動物等方法實現。因為轉基因動物操作復雜、周期長且成本高,目前體內神經元表達光敏蛋白主要采用病毒載體注射的方式,多用安全高效的腺相關病毒AAV(圖2),此外包裝容量大且可跨多級突出傳遞的HSV等嗜神經病毒也逐漸用于光敏蛋白遞送。一般通過特異性啟動子實現光敏蛋白的細胞特異性表達,具體選擇可以參考吉凱基因的神經系統AAV血清型及特異性啟動子選擇指南。

圖2. AAV有效遞送光敏蛋白在神經元中表達

由于光敏蛋白需要在細胞內有足夠的表達水平才能發揮調控作用,因此那些特異性啟動子轉錄活性弱的細胞在應用光遺傳操控時就面臨很大的問題。對于此類問題我們可以利用Cre-loxp系統解決,如圖3構建帶有loxp開關的AAV載體注射到細胞特異性表達cre的小鼠中,由于cre重組酶活性高,使其目的基因序列反轉進而在強啟動子的作用下高水平表達。

圖3. Cre依賴的高表達載體

吉凱基因具有多種光遺傳元件AAV現貨,詳見文末產品列表。此外還提供特殊光遺傳AAV定制服務,滿足客戶各種實驗需求。

三、光的遞送

在光遺傳技術中,要實現對細胞的控制就要保證光能夠照射到相應表達光敏蛋白的細胞,因此光的遞送至關重要。在體外實驗中,我們可以把激光或LED利用顯微鏡的微光路直接照射靶細胞而激活光敏蛋白。但在體內實驗中,光遞送方法的發展制約著光遺傳技術的應用。目前常用的遞送方式是通過輕量的柔性光纖傳遞光信號或者利用雙光子給予特定腦區光刺激。但這些信號遞送方式均需要在動物頭部連接光纖,一定程度上限制了動物的自由活動,影響行為學方面的研究。無線光極的發明則很好的克服了這個問題(圖4)。


圖4. 無線光遞送

在過去的近15年中,隨著更靈敏、定點更準確的新型光敏蛋白的不斷發現,以及各種微損、靈活的光遞送技術的不斷發展。光遺傳技術作為科研之路的希望之光,不僅照亮了神經科學研究,也作為極具潛力的手段應用在如嗜睡、抑郁癥、失明、肌無力、癲癇等多種疾病的臨床治療研究中。


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